内容发布更新时间 : 2024/5/9 10:17:46星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

CXCR3论文：小鼠CXCR3A及人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

【中文摘要】CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,目前已发现三种剪接变体,分别为CXCR3-A(即通常所说的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt。CXCR3A主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞,其配体为CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。近年研究发现,CXCR3A在一些恶性肿瘤细胞表面高表达,通过受体-配体相互作用介导肿瘤的转移和侵袭。CXCR3B主要表达于内皮细胞,除了可与CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC结合,其还是CXCL4/PF4的功能性受体。配体与血管内皮细胞表面的CXCR3B结合可诱导细胞凋亡,在维持血管稳定方面具有重要作用。本研究旨在克隆小鼠CXCR3A基因并将其转入不表达该分子的小鼠黑色素瘤细胞B16中,在体内外研究B16-mCXCR3A细胞的迁移能力和致瘤性。同时克隆人CXCR3B基因,并建立稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,为制备相应的单克隆抗体奠定了物质基础。第一部分小鼠CXCR3A基因的克隆及基因转染细胞株B16-mCXCR3A的构建克隆小鼠CXCR3A基因并构建稳定表达该分子的基因转染细胞株B16-mCXCR3A。采用PCR方法从

pMD19-T/mCXCR3A质粒中扩增小鼠CXCR3A基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染小鼠黑色素瘤细胞B16;G418加压筛选阳性克隆,分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中

CXCR3A在mRNA和蛋白水平的表达。构建了表达小鼠CXCR3A基因的真核表达载体pIRES2-EGFP/mCXCR3A,转染该载体后获得了稳定表达小鼠CXCR3A的B16-mCXCR3A细胞。构建了稳定表达小鼠CXCR3A基因的基因转染细胞株B16-mCXCR3A,此为进一步体内外研究奠定了基础。第二部分B16-mCXCR3A细胞体外迁移及体内对肿瘤形成与转移的影响用已构建的基因转染细胞株B16-mCXCR3A研究小鼠CXCR3A分子在肿瘤形成及转移过程中的作用。采用Transwell系统检测

B16-mCXCR3A细胞在其配体IP-10介导下的迁移能力。将B16-mCXCR3A细胞分别通过皮下和眼静脉注射接种于BALB/c小鼠,观察在小鼠体内的成瘤率及肿瘤转移情况。在20μg/L小鼠IP-10的作用下,B16-mCXCR3A细胞(1×105个)迁移的细胞数为3208个,与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。于小鼠皮下接种B16-mCXCR3A细胞、B16细胞和B16-mock细胞,第20天成瘤率均为100%。于小鼠眼静脉注射B16-mCXCR3A细胞,第21天时50%的小鼠在肺部出现肉眼可见的黑色肿瘤转移灶,B16细胞组和B16-mock细胞组肺部未见肿瘤转移灶,B16-mCXCR3A组与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。转染小鼠CXCR3A基因的B16-mCXCR3A细胞,在小鼠IP-10介导下可定向迁移,并可促进肿瘤的转移。第三部分人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能初步研究克隆人CXCR3B基因,并构建含有该基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B。采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入到真

核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达。MTT分析基因转染细胞株L929-huCXCR3B在其配体Mig作用下的增殖能力。成功克隆了人CXCR3B基因并构建了表达该分子的真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,并获得了稳定表达人CXCR3B的

L929-huCXCR3B细胞,膜表面人CXCR3B分子的阳性表达率为93%。该基因转染细胞与Mig共培养24、48及72h,抑制率分别为41.44%、44.01%和24.80%。构建了稳定表达人CXCR3B基因的基因转染细胞株L929-huCXCR3BB,此为研究CXCR3B信号转导及生物学功能与制备相应的单克隆抗体奠定了基础。

【英文摘要】CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)is a 7-time transmembrane G protein couple receptor. It is known that there are three splice variant, CXCR3-A (namely CXCR3), CXCR3-B and CXCR3-alt. CXCR3A mainly presents at activated and (or) memory T cell, NK cell and Macrophage cell surface. Its chemotatic factor ligands are CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10 and CXCL11/I-TAC. The recent researchs show that CXCR3A is highly expressed on malignant tumor cell surface and mediates tumor transfer and invasion through receptor-ligand interaction. CXCR3-B mainly expressed in human microvascular endothelial cells. Besides with CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10 and CXCL11/I-TAC,