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本次实验项目： 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 本次实验课时：验证性 4学时 教学要求： 1．掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 2．学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的基本结构。 3．能够对实验结果做出正确判断 重 点：考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．蛋白质含量测定的相关知识………………………………………………………… 0.3 学时 2．实验目的……………………………………………………………………………… 0.1 学时 3．实验原理……………………………………………………………………………… 0.2 学时 4．仪器、材料和试剂…………………………………………………………………… 0.1 学时 5．操作步骤及注意事项………………………………………………………………… 0.3 学时 实验教学 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的操作过程……………………………………… 2 学时 参考资料 《生物化学实验》指导书

考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度

相关知识

１．蛋白质含量测定法 在选择方法时应考虑以下几点：

（1）实验对测定所要求的灵敏度和精确度； （２）蛋白质的性质； （３）溶液中存在的干扰物质； （４）测定所要花费的时间。

２.比色分析法

溶液的颜色和光的选择吸取 比色分析的基本原理 光的吸收定律：T%与A或E A ＝KCL

３．考马斯亮蓝：当它与蛋白质结合后变为蛋白质-色素结合物。

考马斯亮蓝R250：R250中的R代表Red，偏红，R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色，λmax=560―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意.

考马斯亮蓝G250：G250中的G就是Green，偏绿，G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定比考马斯亮蓝R250多二个甲基.;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.

一、实验目的

1．掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。

2．学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的基本结构。 二、实验原理

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。

在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于595nm下比色，

Coomassie brilliant blue

可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器

吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或7220型分光光度计。 （二）材料和试剂

1． 标准蛋白溶液：牛血清白蛋白(0.1mg/ml)，准确称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9NaCl溶

液并稀释至2000ml。 2． 末知浓度的蛋白液：

3．染液：考马斯亮蓝G250(0.01%)，称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1000ml。 4. 0.9%NaCl溶液 四、实验操作步骤 （一）标准曲线的制备 管号 试剂 标准蛋白液 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝液/ml 蛋白质浓度/（μg） A595nm 1（空白） 2 － 1.0 4.0 0 0.1 0.9 4.0 10 3 0.2 0.8 4.0 20 4 0.3 0.7 4.0 30 5 0.4 0.6 4.0 40 6 0.5 0.5 4.0 50 7 0.6 0.4 4.0 60 混匀室温静置，15分钟内比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准管蛋白含量为横坐标作图得标准曲线。（可将值代入线性回归方程软件，求出直线方程和r值） （二）未知样品蛋白质浓度的测定

1． 取4支分两组，各加入一定量的不同稀释浓度的待测液（两两相同）。 2． 分别加0.9NaCl溶液补足到1毫升。

3． 分别加入4毫升考马斯亮蓝G250试剂，在室温下放置,15分钟以内595nm进行比色。 问题：①标准蛋白液的量填入表格？

②移液管使用注意事项？

③分光光度计的使用及比色过程注意事项？ ④如何操作才能保证标准曲线的可靠性？

4． 在595毫微米波长下7220型分光光度计比色、读数，记录各管A值。其值要在标准管

吸光度范围内，每组求平均值。 问题：待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础？如何选择未知样品的用量？ 五、实验结果与讨论

1.确定出要用于计算的一组待测液

2.根据标准曲线或回归方程求出待测液蛋白含量是？单位mg/ml 六、注意事项

考虑在整个实验操作过程哪些操作步骤及细节可影响实验结果的准确性。 思考题

1． 如何选择待测样品用来测定浓度的量？