内容发布更新时间 : 2024/5/4 16:18:17星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Western Blot操作流程

本人将自己做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。因为每个实验室的条件不一样，所以本流程仅供参考，具体适合自己的实验操作需要大家摸索。由于知识量有限，有些描述用词并不专业，请大家谅解。

一、 流程图

制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使用立春红检测是否蛋白是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜） →→TBST清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影 二、 物料及配制

1、 电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用） 2、 10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸水

3、 转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收

使用）

4、 TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸水+1ml吐温20。（无

需回收） 5、 封闭液：购买

6、 Ⅰ抗（内参）：将小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀释液 按1:500稀

释待用，4度保存。

Ⅰ抗（目的蛋白58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液 按1:1000稀释待用，4度保存。

7、 Ⅱ抗（内参）：将山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀释液 按1:5000稀

释代用，4度保存。

Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：Ⅱ抗稀释液 按1:5000稀释待用，4度保存。

7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用 8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用 9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1 三、步骤 （一） 制胶

1、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制

溶液成分 双蒸水 30%丙烯酰胺溶液 1.5mol/L Tris（pH8.8） 10%SDS 10%过硫酸氨 TEMED 成分体积（共约10ml） 4ml 3.3ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 2、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液

溶液成分 双蒸水 30%丙烯酰胺溶液 1.5mol/L Tris（pH6.8） 10%SDS 10%过硫酸氨 TEMED 成分体积（共约5ml） 3.4ml 0.83ml 0.63ml 0.05ml 0.05ml 0.005ml 3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。

2）依次将所需试剂加入烧杯中，加入TEMED之后，混匀，用

1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的角交替加入分离胶溶液，也可从左到右连续加入（目的：两种方法都可以使液面快速达到水平状态）。溶液加至玻璃板约2/3高度，然后加双蒸水至满或溢出。室温放置约20min，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标准（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。如果胶凝固后未达到水平状态，需重做。

3）积层胶溶液的加入同上，使溶液至满或略低，将对应1.00mm

规格的梳子嵌入积层胶溶液（同时按压梳子两侧），室温（25度左右）放置约20min，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。

注：TEMED的量要严格把握！若配制的胶过早凝固导致液面未达

到水平状态，或者长时间不凝固，最可能的原因是加入TEMED时出现了较大误差。天气较冷时（10度左右），凝固时间会延长，可放恒温箱中37度加速凝固。

（二） 跑胶

1、将玻璃板放入电泳槽中，加入适量电泳液（要淹没玻璃板顶部）。在梳子两边同时用力，将其拔出。

2、在积层胶最左侧或最右侧的孔中加入4μl 的Mark，然后在剩余孔中依次加入10μl蛋白提取液（蓝色）。加入的Mark和蛋白液的量可适当调整。加入时一定要仔细，视线要与孔保持水平，保证所加蛋白提取液全部落入孔中，否则会影响后期含量测定。