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稀释液及溶液（消毒剂）名称 □pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 □pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 □0.2%新洁尔灭溶液 □75%乙醇溶液 2.6.实验方法

配制批号 有效期至 中国药典(2015年版) 四部：（1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法； （1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法。 2.7.人员资质

验证操作人员应具备微生物限度检查上岗资质，且在验证实施前应对其批准的验证方案进行培训，应能证明验证人员能依照验证方案正确实施。 培训时间 培训人 参加培训人员 确认人： 确认日期：

复核人： 复核日期：

溯源资料

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六、验证内容

1.供试液的制备

1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。

备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.菌液制备

2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养

物至胰酪大豆胨液体培养基中，30?35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至 、 、 、 制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。 2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20?25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至 ，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20?25℃培养5 ?7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至 ，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期

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内使用。 3.计数方法的验证

3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）

所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分 检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。 3.1.1.试验组

取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤 的供试液中含菌量不大于100cfu。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。

—取 的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～

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25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。 3.1.2.菌液组

—取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。各平行制备2个平皿。

—取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。 3.1.3.供试品对照组

—取 的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注15～20 ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。 3.1.4.结果判断

3.1.4.1计算公式：

稀释剂对照组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数

稀释剂对照组菌数的回收率＝

菌液组的平均菌落数

试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数

试验组菌数的回收率＝

菌液组的平均菌落数

3.1.4.2判定标准：

实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在0.5～2之间。若各试验菌的回

收

率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、 霉菌和酵母菌总数计数。 3.1.5试验结果

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供试品批号 、 、 。

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