内容发布更新时间 : 2024/12/22 17:59:54星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Western blot常见问题------麒盟生物

Q: 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

A: 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

Q: 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？

A: 可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

Q: 最后显色时用DAB好还是ECM好？

A: DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物，不易保存；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

Q: 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot实验吗？做这两个实验时的一抗和二抗可以共用吗？

A: ①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

Q: 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？ A: 一般5×106就足够了，具体要看细胞的大小还有目标蛋白的丰度。

Q: 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？ A: 能，没有问题。但一般情况不建议这样操作，除非样本非常珍贵，不易获取。

Q: 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？ A: 当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品，只要蛋白的量足够。

Q: 蛋白变性后可以存放多久？

A: －80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

Q: 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

A: 不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。其实这种体系是很少用到的。

Q: 做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

A: 必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一

点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。

Q: 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

A: 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。简言之，根据具体抗体的说明来定是否可以用同一种抗体。

Q: 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

A: PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Q: 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？ A: 可以。

Q: 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

A: 这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120 mA，45-60 min就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170 kd 用7% SDS－PAGE，200 mA 90-120 min。

Q: 细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

A: 一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。

Q: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

A: 一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

Q: western blot内参选择什么合适？

A: 这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。

Q: 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？

A: 转移缓冲液中加入20% 甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转

移时间。

Q: 转膜时凝胶肿胀或卷曲？

A: 可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10 min。

Q: 跑胶的条带歪斜或者漂移？

A: 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。

Q: 转膜后膜上有单个或多个白点？ A: 转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。

Q: 转膜缓冲液过热？

A: 缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。

Q: 显影后胶片背景太高？

A: 转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。

Q: 结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？