内容发布更新时间 : 2024/12/29 15:52:39星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

一、蛋白浓度的直接测定（UV法）

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。 （1）简易经验公式

蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor （2）精确计算

通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果： 蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D 其中d为测定OD值比色杯的厚度 D为溶液的稀释倍数

二．紫外吸收法测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。 【实验原理】 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。 紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。 【实验材料】 1.实验器材 试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。 2.实验试剂 (1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。 (2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。 【实验操作】 1. 绘制标准曲线 取7支试管按下列各表加入各试剂： 管号 0 1 2 3 4 5 6 试剂 标准蛋白质溶液(ml) 蒸馏水(ml) 蛋白质浓度(mg/ml) 0.0 8.0 0.000 0.5 7.5 0.125 1.0 7.0 0.250 1.5 6.5 0.375 2.0 6.0 0.500 2.5 5.5 0.625 3.0 5.0 0.750 试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。 2. 测定未知样品 取样品溶液4毫升,加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。 【实验结果】 根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。 二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

三．双缩脲法（Biuret法）

实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9 L' B P n! 试剂与器材

试剂：' T! `$ d3 V, J% A

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。1 ^) ^+ }: ~1 L2 ~ N\

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 器材：) m, W4 G% C9 ~, w) O

1. 可见光分光光度计) q A4 S8 X9 t, n 2. 比色杯 3. 大试管15支 4. 旋涡混合器等。

操作方法2 G0 ?3 _+ ^- h) F V

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，

用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2. 样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

四．BCA方法测定蛋白质含量 【实验目的】 掌握用BCA方法测定蛋白质含量的原理和操作方法 【实验原理】 BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu络合生成络合物，同时将Cu还原成Cu。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。 【实验材料】 1.实验器材 721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。 2.实验试剂 (1) BCA试剂的配制 ① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3?H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6?2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。 ② 试剂B，50ml：取2g CuSO4?5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。 ③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。 (2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。 (3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。 【实验操作】 1.绘制标准曲线 取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。 管号 1 2 3 4 5 6 +2+2++