内容发布更新时间 : 2024/11/16 18:32:18星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
离子交换柱层析分离与纯化凝集素
一、实验目的
本实验以红花石蒜为材料，将其粗提液进行硫酸铵沉淀后，再用离子交换柱层析进行分离。本实验的目的是：了解离子交换层析技术的原理，掌握用离子交换层析技术分离蛋白质的基本技术。 二、实验原理
离子交换层析分离蛋白质的过程,主要是利用蛋白质具有不同的电荷而进行分离。依靠增加缓冲液中的离子强度或改变pH值使蛋白质带不同种类和数目的电荷，改变蛋白质与离子交换剂的结合状况,从而使不同的蛋白质得以分离。要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值），使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。
离子交换剂是连接有离子基团的不溶性惰性颗粒，可由多种材料制成,如纤维素,葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶和合成树脂。常用于蛋白质分离纯化的离子交换剂为离子交换纤维素,离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。带正电荷的离子交换剂可以靠静电结合阴离子，称为阴离子交换剂。带负电荷的离子交换剂称为阳离子交换剂。离子交换剂根据带电基团解离程度的不同,又有强弱之分。强离子交换剂的带电基团在所有pH范围内解离；弱离子交换剂的带电基团的解离状态则取决于pH，只在一定pH范围内解离。 本实验采用的凝胶柱为DEAE-Sephrose阴离子交换琼脂糖凝胶柱。 三、试剂与器材
主要试剂：弱碱型阴离子交换琼脂糖凝胶：DEAE-Sephrose，NaOH，NaCl，Tris，盐酸，乙醇。
主要溶液：
生理盐水、0.5M NaOH溶液、0.05M, pH7.6 Tris-HCl缓冲液、0.05M, pH7.6 含1M NaCl的Tris-HCl缓冲液
主要器材：
离子交换层析柱、储液瓶、梯度洗脱仪、紫外检测仪和记录仪、部分收集器、pH计、恒流泵、透析袋
四、试剂配制
1．配制1L，0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液 （Mr=121.14）
称量60.57g Tris，加入400ml蒸馏水将粉末溶解后，加入适量盐酸调pH值至7.6，最后定容至1L
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2．配制2L, 0.05M, pH7.6的Tris-HCl缓冲液
取200ml 0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液定容至2L，分4瓶存放（500ml/组）
3．配制2L, 含1M NaCl的0.05M, pH7.6的Tris-HCl缓冲液
取200ml 0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液，称量117g NaCl，定容至2L，分4瓶存放（500ml/组）
4．配制1L 0.5M的NaOH溶液
称量20g NaOH，定容至1L，分4瓶存放。
五、材料
石蒜鳞茎采自四川西部山区，12月-1月成熟的鳞茎
新鲜兔血采自菜市场，以生理盐水洗涤三次，至离心上清无色，备用 六、操作步骤 1． 凝胶柱的准备 (1) 离子交换剂的制备:
DEAE-Sepharose阴离子交换剂的制备：按试剂说明将凝胶用低水水洗，洗去残留的乙醇，抽干，用0.5M NaOH（含1M NaCl）浸泡2小时，抽干，水洗至中性。
用带有所要离子的溶液浸泡离子交换剂,而后再用蒸馏水冲洗至中性。 ⑵ 装柱:
①将柱子固定于铁架上,用铅垂校正垂直。
②加入洗脱液，打开柱出口排除气泡.待柱内剩余约2cm柱高的液柱时，关闭柱出口。 ③调节凝胶悬液,使凝胶与溶液之比约为3比1。
④将凝胶悬液充分混合，然后一次性倾入柱内，注意此时凝胶的温度与层析时的温度一致。⑤待凝胶自然沉降形成1-2cm高的凝胶柱后，打开出液口，直到凝胶沉降到所需要的高度为止。
⑥柱沉降形成以后，用洗脱液滴注平衡2-3个柱床体积，使凝胶柱床稳定，平衡时流速可稍大于层析时的流速。还应注意胶面上保持2-3cm液柱，以防柱床干掉对于装好的柱，以10倍柱体积的起始缓冲液平衡柱体。 2．石蒜凝集素粗提液的制备
⑴ 将石蒜球茎上的泥土洗净，加入3倍生理盐水，用搅拌器匀浆，在4℃下放置过夜，过滤得到上清液。
⑵ 将上清液进行硫酸铵分级沉淀（30～60％），3500rps离心20min，得到凝集素粗品。 3．紫外吸收法对蛋白质浓度的测定
取石蒜凝集素粗品溶液，过滤。取1ml滤液，稀释10倍，用紫外分光光度仪测定溶液在260nm和280nm的吸收值，根据公式：
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1.45*OD280－0.74*OD260 计算蛋白质浓度。
4．石蒜凝集素的分离和纯化
⑴将粗品以0.05M pH7.6的Tris-HCl缓冲液透析除去硫酸铵 ⑵用相同的缓冲液平衡的DEAE-Sephrose FF离子交换柱
⑶上样：取滤液200ml，以2ml/min（大约2-3秒/滴）的流速上柱。
⑷洗脱：上样结束后，用缓冲液以5ml/min流速洗脱至OD280<0.02，改用0～1mol/L NaCl溶液进行连续梯度洗脱至OD280<0.02, 以处理好的新鲜兔红细胞检测活性,收集活性部分透析除盐,浓缩保存。
5．柱子的清洗：0.5M NaOH溶液（含1M NaCl） 七、实验结果和数据处理
以层析流出时间为横座标，以相应的A 280值为纵座标，作出DEAE-Sephrose阴离子交换琼脂糖凝胶柱分离石蒜凝集素粗提液的洗脱曲线。
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