内容发布更新时间 : 2024/12/27 9:27:16星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。

Messing 及其同事已经构建了许多携带 F' 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其

中最重要的遗传标志有：

（1） lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突变体。 （2） D（lac-proAB）lac 基因缺失突变体。

（3） lacIq lacI 基因的突变体。

（4） proAB 细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。

（5） traD36 抑制 F' 因子接合转移的突变。

（6） hsdRl7 与 hsdR 4 对大肠杆菌 K 株 Ⅰ 类限制 - 修饰系统失去限制活性但仍保留修饰

功能的突变体。

（7） recA1 大肠杆菌重组酶基因。

（8） supE 琥珀抑制基因。

在 M13 噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。 JM101 supE D （lac-proAB）[F'traD 36 proAB + lac I q lacZ D M15]

JM105 JM101/ hsdR 4 JM107 JM101/ hsdR 17 JM109 JM101/ hsdR 17 recA1 TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制）

XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 [F' proAB + lac I q lacZ D M15]Tn 10 （Tet r）

四、噬菌粒载体（phagemid vectors）

噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体 DNA 合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因 Ⅱ 蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生 ssDNA 并进行

包装。

克隆于这些载体内的外源 DNA 区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带有这种质粒的细菌被 M13（或 f1） 丝状噬菌体感染后，在病毒的基因 Ⅱ 蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。基因 Ⅱ 产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒 DNA 一条链的拷贝，最终包装在

子代噬菌体颗粒中。

常用的如pUC118/pUC119。由带有M13复制起点的M13的基因间隔区（IG）和pUC18/pUC19质粒载体的质粒复制起点、Ampr、lacZ’、MCS等构成。pUC118 和 pUC119 是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源 DNA 片段的大小不那么敏感，并且保留了 pUC 质粒在克隆操作方面的优点。在 pUC18/19 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列（IG），当含这些质粒的细胞被适当的 M13 丝状噬菌体感染时，可合成质粒 DNA 的其中一条链，并包装在子代

噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链 DNA ，用于 DNA 序列测定、定点诱变或制备探针。pUC118/pUC119有两种不同的复制模式：1）双链质粒复制模式，受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。2）单链滚环噬菌体复制模式，来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。 噬菌粒具有以下特征：① 双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征； ② 免却了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； ③ 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链；④两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。

因此，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅

助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。

图4-13 Puc118/119

五、M13KO7 辅助噬菌体

M13KO7 辅助噬菌体是 M13 的衍生株，大小为 8.7kb。 M13KO7 噬菌体带有来自 p15A 质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带 ColE1 的质粒共存于同一个宿主菌中。还带有一个来自转座子 Tn903 的卡那霉素抗性基因（kanr），用作选择标记。基因 Ⅱ 带有一个 G 至 T 的突变（第

6125 核苷酸），导致基因 Ⅱ 蛋白第 40 位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。

当 M13KO7 感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如 E.coli（pUC118），进入宿主细胞内的单链

DNA ，在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒 p15A 的复制起点控制下进行复制。由于细胞内 M13K07 双链 DNA 的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的

M13K07 病毒基因组的早期复制。

M13KO7 基因组双链 DNA 可表达产生子代单链 DNA 所必需的所有蛋白。但 M13K07 中突变的基因 Ⅱ 产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒 pUCll8 和 pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链 DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自

噬菌粒的单链 DNA 能够占据优势。

六、PCR产物克隆载体---T 载体

1．pCR系列载体

是Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。由pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性构成。突出特点是MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。因PCR产物往往在3’端突出一个A，所

以能与这个载体直接连接。

图4-14 pCR2.1的MCS

2．Promega 公司的T载体系列

如pGEM-T vector

图4-15 pCR1

图4-16 pTarget vector，G418抗性。可在真核生物表达。

M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性：