内容发布更新时间 : 2024/12/27 8:21:32星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

第一，单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA（replication form DNA，简称RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。

第二，不论是RF DNA还是ssDNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。 第三，单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说，并不存在包装限制的问题。

第四，应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。

第五，可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定，也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。 下面以M13噬菌体为例子加以说明。

一．M13噬菌体的生物学特性

M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（十）链的DNA，有时亦称为感染性的单链（图5-11）。

M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端（图5-12）。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按θ形式进行几轮复制之后，基因 Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13（＋）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA（图5-13）。

二．M13克隆体系

（1）β-半乳糖苷酶显色反应原理

M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分，只有将两者结合在一起时，才能形成有功能的β-半乳糖苷酶，而且这种酶的活性还可以用Xgal显色反应法测定出来。 所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

顺反子互补作用偶然也能够以多肽片段的形式出现。M13克隆体系就是一个典型的例子。lac缺失突变lacZ（△M15），简称M15基因（不要同M13噬菌体混淆），合成的是一种缺失了11～41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶（又称M15多肽）。这段缺失虽然不是位于酶分子的活性部位，但却使它失去了四聚化作用的功能。在体外加入野生型的β-半乳糖苷酶的溪化氰片段（cyanogen bromide fragment）（2～92氨基酸），就可以使多肽的活性得以恢复，并重新获得形成四聚体的能力。因此，我们说澳化氰片段补偿了lacZ基因的 M15突变。

这种现象叫做α-互补作用（alpha complementation）。

在M13克隆体系中，当M13mPl载体感染了JM101菌株，通过A互补作用，这些细胞便会产生出有活性的β半乳糖苷酶，于是在补加有指示剂Xgal和诱导物IPTG的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。 （2）M13载体系列的发展

在M13噬菌体基因Ⅱ和IV之间（从第5498个核苷酸起到第6O05个核苷酸止），有一个长度为 507个核苷酸的基因间区段（intergenic region，IG区段）。通过在这个基因间区段内插入外源 DNA片段，对 M13噬菌体进行改建，并因此成功地发展出了M13克隆载体系列。 （3）M13载体系列的优点

M13载体系列特别适用于克隆单链的DNA分子。它具有两个十分有用的优点：第一个优点是，在这类载体的基因组中有一条饰变的β半乳糖苷酶基因片段（Hindll片段）,其中插入了一段具有密集的多克隆位点（polycloning site）的序列（图5-14）；第二个优点是，M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。