第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体

内容发布更新时间 : 2024/12/25 22:04:00星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

噬菌体部分:c.噬菌体DNA复制起点与终点;

d.噬菌体形态发生有关的序列;

c.噬菌粒优点:

① 克隆在phagemid上的外源DNA可以像质粒一样按常规方法增殖,形成双链DNA,既稳定又高产,具有常规质粒特性; ② 复制方式可以被改变,从而产生单链DNA

当带有噬菌粒的大肠杆菌细胞被适当的丝状噬菌体感染之后,在噬菌体GeneII蛋白质影响下,噬菌粒的复制方式发生改变。GeneII蛋白质与噬菌粒的基因间隔区相互作用,启动滚环复制,产生单链DNA拷贝。这些单链的噬菌粒的DNA经切割形成切口,然后环化,并被包装进子代噬菌体颗粒中去。可从这些子代噬菌体颗粒中提取单链DNA用作:

a. 用作模板以测定外源DNA区段的单链核苷酸序列;

b. 进行寡核苷酸定点突变; c. 合成单链特异的DNA探针。

③不必进行亚克隆即可进行测序(见②-a)

可直接进行克隆DNA片段的序列测定,免去了从质粒载体到

噬菌体这一既繁琐又费时的亚克隆步骤。

④可产生大片段外源单链DNA(可得到较长的外源DNA之单链序列)由于载体足够小,故可得到长达10kb的外源DNA的单链序列。

3.若干常用的噬菌粒载体

用来自不同丝状噬菌体的基因间隔区插入不同的质粒中,已获得一批噬菌粒。(目前还构建成了一批更加复杂的噬菌粒系统)。若干常用的噬菌粒的基本特征及其寄主菌株列于下表之中。

常用噬菌粒特征一览表

质 粒

pEMBL(From pUC8 pBR322 pRSA101(From

VX

pUC118/pUC119(From pUC18/pUC19

基因间隔区

f1 M13 M13

辅助病毒

IR1, f1的一种抗干扰变异株

野生型M13噬菌体 一种对于带M13基因间隔区的质粒所引起的干扰具有抗性的M13变异株 M13 K07,其基因II发生突变,相应产物对克隆于pUC119/pUC118的基因间隔区的作用优于对自身间隔区的作用。 M13K07

寄主菌株 71/18 KK2186 XS127 XS101 MV1184

M13

pBluescript f1 XL1-Blue

* pBluescript是一种常用的噬菌粒,它的全名称应是pBluescript M13(+/-),或者是分开写成pBluescript M13+、pBluescript M13-;它们是一对带有f1噬菌体DNA复制起点的载体。该起点以互为相反的方向插入到含有T3和T7噬菌体启动子的一个来自pUC19质粒的载体当中。

4.PBluescript噬菌粒载体

(1)体外转录载体:

定义:将T3、T7或SP60噬菌体的启动子,组入到噬菌粒载体

多克隆位点区(MCS)的两侧,便构成了一类新型的噬菌粒载体,叫体外转录载体。

a. 有一类噬菌体(如T3、T7及沙门氏菌的SP6等)

具有编码自身RNA聚合酶基因

此类phage RNA聚合酶基因的转录活性是由寄主RNA聚合酶控制的。

b. 但是,噬菌体晚期蛋白质“或是子代噬菌体的结

构组份,则是由噬菌体基因编码的。

此类噬菌体基因的转录活性是由噬菌体自身的RNA聚合酶控制的。

c. 噬菌体RNA聚合酶的活性效应具有高度的专一

性,只能转录具有噬菌体待定启动子的基因。而且每一种此类噬菌体的RNA聚合酶所识别的自身启动子也是高度特异的。

由于上述这三种原因,所以将T3、T7或SP6噬菌体的启动子

序列组入到噬菌体载体的多克隆位点区(MCS)的两侧,便构成了一类新型的噬菌粒载体,特

称为体外转录载体(in vitro transcription vectors)。

在体外系统中,加入适当的噬菌体RNA聚合酶,就可使相应的噬菌体启动子发生功能作用,从而使插入在多克隆位点中的外源DNA发生转录作用。*

*即加T3 RNA聚合酶,就会启动T3启动子进行转录;加入T7 RNA聚合酶就会启动T7启动子进行转录。 (2)pBluescript噬菌粒载体的结构特征 名称的来源与沿革:

“pBluescript”是一专用商品名称,系指由Stratagene公

司发展的一类从pUC载体派生出来的噬菌粒载体。 此类载体正名为:pBluescript M13(+/-) 以后改名为:pBS(+/-)

现在叫做:pBluescript KS(+/-)或pBluescript SK(+/-) 符名注释:

*1.SK表示多克隆位点区的一种取向,即lacZ基因是按照SacI→KpnI方向转录的。

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