内容发布更新时间 : 2024/11/14 15:08:46星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
图5-36 pUC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构
(2)pUC118和pUC119的复制模式 a.质粒复制型
当其寄主细胞没有感染上辅助噬菌体M13的情况下，这两个噬菌粒载体(pUC118和pUC119)的复制是受来自ColE1质粒的复制起点控制的，即按照双链质粒DNA一样复制，称质粒复制型。 b.噬菌体复制型
当寄主细胞受到辅助噬菌体M13感染之后，噬菌粒载体pUC118和pUC119便会按照M13噬菌体的滚环模型进行复制。此时它们是受位于pUC质粒上的M13噬菌体之复制起点控制的，此种复制称为噬菌体复制型。
当噬菌粒载体按照噬菌体复制模型进行复制时，所产生的单链载体RNA分子，同样也可以被包装进由辅助噬菌体提供的外壳蛋白质，形成的噬菌体颗粒随后便被挤压出寄主细胞。 c.辅助噬菌体(helper phage)
*1.协助相关的克隆载体，并与之一道进入寄主细胞，并为克隆载体的复制提供所需核酸酶及其它蛋白质(如包装用的
外壳蛋白质)，这样的噬菌体称辅助噬菌体。
*2.最常见的辅助噬菌体是M13的一种派生菌株M13K07。辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变体。既然如此，它们自身又是如何遗传的呢？——当寄主细胞不存在pUC118和pUC119的情况下，辅助噬菌体表达的复制蛋白质，可以同突变的复制起点结合，尽管复制效率有限，但仍可产生出足够数量的M13K07噬菌体，保证了遗传的稳定性。
图5-37 pUC118和pUC119噬菌粒载体的两种复制模型 (a) 在无辅助噬菌体的条件下，按双链质粒DNA的复制模型复制； (b) 在有辅助噬菌体条件下，按单链噬菌体DNA的滚环复制模型复制。
(3)pUC118和pUC119的优点
a. 具有cccDNA，可克隆10kb外源DNA，容易操作； b. 编码ampr基因，供作选择记号；
c. 具高拷贝数(500/cell)，故只需少量的培养物，便可制备到大量的外源DNA；
d. 存在多克隆位点，便于基因克隆与插入；
e. 可以按照xgal-IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组体分子；
f. 插入的外源基因可也进行表达；
g. 含有一个质粒复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，可产生出大量的双链DNA分子；
h. 含有一个M13噬菌体复制起点，在具辅助噬菌体的条件下，可合成出大量的单链DNA，形成噬菌体颗粒；
i. 在pUC118和pUC119两个载体中，MCS的序列取向彼此相反，故两者可分别转录克隆基因的正链和负链，形成(+)链RNA和(-)链RNA；
j. 无需亚克隆便可直接对克隆的DNA进行核苷酸序列测定； (4) pUC118和pUC119噬菌粒载体的克隆程序 a.体外重组：克隆的外源DNA同载体分子连接
↓
-半乳糖苷酶形成融合蛋白质的形式
b.转化：将连接混合物转化具lacZ△15的E.coli之Amps表型
菌株
↓
c.选择：涂布在Xgal平板上，选择重组子
图5-39 通过加衔接物的方法在pUC119噬菌粒载体上克隆目的基因的基本程序
5．影响噬菌粒单链DNA产量下降的可能因素
许多噬菌粒在辅助噬菌体感染后，有时其单链DNA的产量较低，且重复性也差。只相当于带有同一外源DNA区段的丝状噬菌体载体的病毒颗粒产量的1/100-1/10，其影响因素可能是： A.噬菌粒携带的基因间隔区的确切序列
携带完整基因间隔区的质粒，由于干扰了辅助病毒DNA的复制，从而抑制了子代噬菌体颗粒的产生。 B.基因间隔区插入质粒的具体位置
基因间隔区插入pBR322HindⅢ位点所构成的噬菌粒，会严重