内容发布更新时间 : 2024/12/31 20:15:01星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
浅谈质粒抽提试剂盒基本原理
碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒，是每个分子生物学实验室都要用到的常规技术，但是大家 对碱法抽提质粒的原理知之甚少。
一、碱法抽提质粒用到的三种溶液及硅酸纤维膜（超滤柱）
溶液 I：50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液 II：0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液 III：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。
二、溶液I中各成分的作用
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因此有些试剂厂商的溶液I没有
葡萄糖成分；EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从
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2+
而达到抑制DNase的活性。
三、溶液II中各成分的作用
NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双 层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO发生反应，形成碳酸钠，降
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低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性， 同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样 的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。
四、溶液 III 中各成分的作用
溶液 III 中的醋酸钾是为了使钾离子置换 SDS 中的纳离子而形成了 PDS，因为十二烷基硫酸 钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS 是不溶水的，同时一个 SDS 分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量 沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打 断 DNA，所以要中和。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50－100 kb 大小的片断，就没有办法再 被 PDS 共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大
量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。75%酒精主要是为了清洗 盐份和抑制 Dnase；同时溶液 III 的强酸性也是为了使 DNA 更好地结合在硅酸纤维膜上。
得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA
会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要
认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的
话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位 置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有 复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这
条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100 kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。