内容发布更新时间 : 2024/12/27 11:43:41星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中将chr.载体均匀的分配到子细胞中）；
一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定；
选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因）； 克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。
第五章 表达载体
16、表达载体启动子的种类 Plac 启动子（诱导型启动子）、Ptac 启动子（诱导型启动子）、T7启动子（T7噬菌体）和PL启动子（λ噬菌体）
17、T7启动子的工作原理（参见PPT图文）
第六章 基因操作中大分子的分离和分析
18、质粒DNA的提取原理及步骤（实验） 碱裂解法提取质粒DNA原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条链仍保持在一起，因此复性迅速准确，而线性染色体DNA的两条链彼此已经完全分开，复性就不会那么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。书本p100-101 碱裂解法小量抽提质粒
(1)将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl
pH8.0,10mmol/L EDTA)中,剧烈震荡;
(2)加200μl新鲜配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS), 缓和震荡,水浴5min;
(3)加150μl预冷溶液III (50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)缓和震荡,冰浴5min;
(4)4 ℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中 (5)向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中;
(6)向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5~10min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体;（析出DNA）
(7)用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清，自然干燥;（洗出金属盐离子）
(8)加20μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解 (9)凝胶电泳检测抽提结果，剩下的DNA放-20°C冰箱保存。 19、凝胶电泳检测原理、种类、过程、注意事项
凝胶电泳的原理：当一种分子被置于电场中，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身携带的净电荷成正比。在电场中，DNA带有负电荷，向正极泳动。在一定的电场中，DNA分子的泳动速度取决于核酸分子本身的大小和构型。
种类：琼脂糖凝胶电泳（凝胶浓度越大，孔隙越小，越适合小分子，DNA结构，DNA分子量 , V共价闭环〉V线状〉V开环状）、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 脉冲场凝胶电泳 20、SDS-PAGE原理、各成分作用
原理：SDS-PAGE(分离蛋白质和寡核苷酸)，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂(巯基乙醇、二硫苏糖醇)能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 各成分作用，
聚丙烯酰胺：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCl系统； TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
21、PAGE与琼脂糖凝胶电泳的区别（书本p102-103） 检测大小（PAGE分辨率更高）
支架（琼脂糖，丙烯酰胺聚合（隔绝空气-垂直结构，加促凝剂）） 垂直与水平结构 百度完善...
22、分子杂交种类、原理、过程 Southern 杂交；
Southern 印迹杂交由E. Southern于1977年建立。它根据毛细管作用原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA 探针
的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。
过程：1、酶切；2、电泳/照相；3、变性/中和 变性试剂：0.4M NaOH 中和试剂：0.5M NaOH /1.5M NaCl 或1M Tris （pH7.4）/1.5M NaCl；4、转移 转移方式：毛细管 电转移 真空 转移buffer：6×SSC（或SSPE）；5、固定 80℃ 2hr，或者UV照射，microwave Northern杂交；
主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似，变性试剂不同等，见作业百度。
Western杂交；转移的是蛋白质而不是RNA 菌落杂交（菌落原位杂交）： 其他分子杂交p109 噬菌斑杂交：书本p109 斑点杂交（斑点印迹杂交）：将通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。 狭线杂交： 23、探针种类
同源或部分同源探针、总cDNA探针、特异性cDNA探针、人工合成的寡核苷酸探针 24、E.coli 感受态细胞制备过程PPT 25、DNA导入大肠杆菌的方法 影响转化的因素：
DNA分子导入大肠杆菌主要通过转化来完成，λ噬菌体和M13噬菌体感染宿主细胞时分别涉及转导和转染过程
转导，感受态细胞，CaCL2转化法，电转化法
转染:采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ噬菌体DNA分子导入受体细胞的过程。
转导:通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。
26、重组DNA分子导入真核细胞的方法
电穿孔法、基因枪法、 显微注射法、脂质体介导法、 花粉管通道法，农杆菌介导 27、重组子的筛选方法 （一）遗传表型直接筛选法 1）、根据载体选择标记初步筛选转化子
抗药性筛选； 插入失活筛选法； 插入表达筛选法； 显色互补筛选法 2）、营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。若目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记或基因产物与某些药物作用是颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。该方法的使用前提是待选择的目的基因能在受体菌中进行表达。 3）、形成噬菌斑筛选法
λDNA载体被外源DNA分子插入后，重组 DNA分子大小必须在野生型λ DNA长度的75~105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长。噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子。 （二）依赖重组子结构特征分析的筛选法 1）、快速裂解菌落鉴定分子大小（质粒快检）
此法主要是根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小 差异来区分重组子和非重组子。 2）、限制性核酸内切酶酶解分析法
通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法虽可初步筛选到重组子菌落，但却难以将其中的期望重组子和非期望重组子区分开，因为重组质粒DNA中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组，而采用限制性核酸内切酶分析法不仅可进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA的插入方向及分子质量大小等。 3）、利用PCR方法筛选重组子 载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多为固定已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。 28、RNAi的概念和作用机制（RNA干扰） RNAi（RNA interference ）是由双链RNA分子在mRNA水平阻断相应基因表达或使其沉默的过程。它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵而保持自身遗传稳定的保护性机制。目前在果蝇、真菌、昆虫、植物以及哺乳动物中均有发现。
RNAi作用机制：长链dsRNA被切割成20-25nt长度的片段，即siRNA。siRNA与核酸诱导的沉默复合物（RISC）结合，作为模板识别目的mRNA。通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA被相关酶切割产生22nt左右的siRNA，后者与RISC结合，继续反复切割mRNA，从而使基因沉默。
29、miRNA的概念和作用机制 Small RNAs主要包括两大类：
? miRNAs (microRNAs)
? siRNAs (short interfering RNAs)
miRNAs普遍存在于动植物体内，影响基因表达、细胞周期调控和个体发育，它由非编码基因转录物形成的茎环结构加工而来，长度22nt左右；
成熟miRNA的5’端为磷酸基团，3’端为羟基； 表达具有严格的时序性和组织特异性；
无ORF，多存于间隔区，进化中结构高度保守。
第八章 PCR技术及应用
30、PCR的概念、基本要素、具体步骤、反应体系 PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应，是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。 基本要素：引物、 dNTP、 耐热DNA聚合酶、模板DNA 具体步骤：变性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37 ～ 72 ℃；
延伸（extension）：72 ℃。
PCR反应体系
①脱氧核苷三磷酸（dNTP），dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：2.5mM，使用浓度：200μM。使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。 ②缓冲液（buffer）：TAE，TBE，TPE（T-Tris，E-EDTA，A-乙酸，B-硼酸，P-磷酸）PCR标准缓冲液含10mmol/L Tris*HCL，PH8.3-9.0。作用：缓冲PH，提供部分反映成分。 ③引物（primer），最佳引物使用浓度为0.1 μM ~1.0 μM 之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。引物长度＜20nt时：Tm=4×（G+C）+2×（A+T） 引物设计要求:
? 设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3’端的一段核苷酸序列互补,且3’端必
须有游离的-OH基团；(从3端开始接合模板链,PPT上思考题选A，D) ? 引物一般由20~30个核苷酸组成，4种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达40~60%； ? 引物中应尽量避免回纹序列出现；
? 引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。
④模板DNA，作为PCR 的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端