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班级:14级生物1班 姓名:王堽 学号:20140322142
实验六:体细胞Barr小体的观察
一．目的
1.了解Barr小体的发现及其形态；
2.学习人类Barr小体的检测方法；
3.认识雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制；
4.了解性别决定机制。 二．原理
（一）异染色质及barr小体 1.异染色质的介绍及其功能
（1）在细胞周期中，间期、早期或中、晚期，某些染色体或染色体的某些部分的固缩常较其他的染色质早些或晚些，其染色较深或较浅，具有这种固缩特性的染色体称为异染色质（heterochromatin）。具有强嗜碱性，染色深，染色质丝包装折叠紧密，与常染色质相比，异染色质是转录不活跃部分，多在晚S期复制。异染色质分为结构异染色质和功能异染色质两种类型。结构异染色质是指各类细胞在整个细胞周期内处于凝集状态的染色质，多定位于着丝粒区、端粒区，含有大量高度重复顺序的脱氧核糖核酸（DNA），称为卫星DNA（satel-lite DNA）。功能异染色质只在一定细胞类型或在生物一定发育阶段凝集，如雌性哺乳动物含一对X染色体，其中一条始终是常染色质，但另一条在胚胎发育的第16～18天变为凝集状态的异染色质，该条凝集的X染色体在间期形成染色深的颗粒，称为巴氏小体（Barr body）。 （2）区别
常染色质易被碱性染料染成浅色，或对孚尔根反应呈弱阳性。异染色质易被碱性染料染成深，或对孚尔根反应呈阳性。 （3）功能
关于异染色质的功能，目前还未深入了解。但以下的几点是明显的。 ?结构型异染色质可以加强着丝点区，使着丝粒稳定，以确保染色体分离。 ?可以隔离和保护重要基因（例如NOR区的18S和28S基因），防止或减少基因突变和交换。 ?促进物种分化，同源染色体可通过其异染色质区的重复序列在减数分裂时配对，这种配对能帮助染色体全长的联会。重复序列中可以容纳突变，进而形成新的不同重复序列，由此而促进物种的分化和形成。 ④有利于非必要基因在生存竞争中被淘汰。 ⑤具有斑点位置效应能导致常染色质异染色质化，使其中的基因表达受到抑制。
⑥异染色质可以从两个方面参与基因调控：一是通过一种与“异染色质化”有关的过程，使多数大片段的染色质结构关闭;二是通过稳定更多的已开放的染色质结构来避免其关闭结构状态的存在。 2.barr小体的发现、形状及其应用
（1）1949年Barr和Bertran在研究猫的间期神经细胞时，发现雌猫体细胞核膜边缘有一个可被碱性染料染色的小体而雄猫没有。后来发现人类正常女性口腔上皮、阴道上皮、皮肤、羊水等的细胞中都有一个这样的小体，继而有人进一步发现所有哺乳动物雌体细胞中都有同样的一个小体。一般认为这种小体是两个X染色体中的一个在间期发生异固缩形成的，故而将其称为X小体，X染色质，
又称为Barr小体。经观察，X小体一般1~1.5微米，呈三角形或卵圆形。
Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核膜边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致，Morishima等利用放射性标记的方法证实了失活状态的性染色体与其他异染色质（heterochromatin）一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质，且大多出现在核膜边缘。性染色质的数目是X染色体数减1。故可以根据X小体的有无、数目来鉴定胎儿的性别和性别畸形。 （2） 应用
通过巴氏小体检查可确定胎儿性别和查出性染色体异常的患者，如克氏（Klinefelter′s）综合征患者外貌为男性，但有一个巴氏小体，可判定患者的核型是47，XXY；而外表为女性的特纳氏（Turner's）综合征患者却无巴氏小体，故判断患者的核型是45，XO。其他性染色体异常的患者如XXY、XXYY有1个巴氏小体，而XXX、XXXY有2个巴氏小体等。
利用Barr小体预测胎儿的性别，方法是用羊水细胞、胎盘绒毛膜细胞以及最近采用孕妇的血、尿、宫颈粘液等制作装片，在显微镜下观察是否具有Barr小体，若有Barr小体，则为女，若无Barr小体，则为男。但是这种方法预测的不一定只精确的，原因是用些男性细胞中也有可能出现Barr小体，还有一些人患有性染色体异常病或者是性染色体为XO型，出现这些情况，仅仅用检测Barr小体的方法是预测不出胎儿的性别的，还要其他的方法与之结合才能准确的预测出胎儿的性别。其他预测方法有Y荧光小体、微量免疫扩散法、性染色体、嗜中性粒细胞鼓缒体等。
3.剂量补偿效应
Muller于1932年提出剂量补偿效应，就是使具有两份或两份以上的基因量的个体与只具有一份基因量的个体的基因表现趋以一致的遗传效应。 4.莱昂假说（Lyon hypothesiis）：
（1）巴尔小体是一个失活的X染色体，失活的过程就称为莱昂化（lyonization）；
（2）在哺乳动物中，雌雄个体细胞中的两个X染色体中有一个X染色体在受精后的第16天（受精卵增殖到5000-6000，植入子宫壁时）失活； （3）两条X染色体中哪一条失活是随机的；
（4）X染色体失活后，细胞继续分裂形成的克隆中，此条染色体都是失活的；
（5）生殖细胞形成时失活的 X染色体可得到恢复的。
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（二）性别分化的相关介绍 1.性别的产生
性别的产生,笼统的说，当然是进化产生的，既自然选择的结果。 自然选择为什么会产生这样的结果呢？理所当然是有利于生物的生存。生物性别产生以后，本来一个生物个体就可以完成繁衍后代的任务，变成了两个雌雄个体的合作才能完成任务。应该说是样一种麻烦，不方便，有所限制。传播后代量也降为原来可能的一半，既传播后代的能力降为原来的一半。如果考虑到麻烦，不方便，有所限制。那么性别产生后，有性别的单个个体繁衍后代的能力，降低的会更多。繁衍后代的能力大概会是原来的30%或者更底，如20%等。 繁衍后代的能力大大降低了，但这些有性别的生物却普遍的存在着，应该是进化的胜利者。这是为什么呢？答案在于繁衍的后代的生存适应能力上。性别产生而繁衍的后代，基因有所不同或有点差异。就这点点差异是决定有性别生物，生存能力强大的根本原因。因为这点点差异使同一生物的不同的后代适应环境的能力有所差别，既这些不同的后代各自适应不同的最佳环境，虽然各自适应的最佳环境差别极小，但意义极大。
无性别的生物的后代无基因差别，当然都只能共同的，适应相同的某一种的最佳环境。这一点也很重要，这是无性别生物的一大缺点。无性别生物个体的众多的后代，只能在一处最佳环境相互竞争生存。环境稍有变化，便不太适应。而有性别的生物的后代，由于基因略有不同，适应的最佳环境也略有不同。因此这些基因略有不同的后代，在各自的最佳环境里处于最佳发展前途，减少了与自己的同种生物竞争的程度，而那些没有性别的生物的后代就不能这样了。这也算有性别的生物的一个好处之一把。 更为重要的好处是。生物的生存环境是变化的，因此生物也必须跟上这种变化。有性别生物个体与无性别生物个体在适应环境的变化上就有差别了。因为环境一般是漫漫变化的，有性别生物个体在适应环境上是有差别的，环境变了一点，在众多的有性别生物个体的后代中，总有最佳适应这种环境的个体，这种最佳适应这种环境的个体当然处于最快发展速度。很快这样的个体会越来越多，处于优势。其它个体不太适应新环境，逐渐在减少。而那些没有性别的生物，大家基因一样，要适应，都适应。要不适应，都不适应。环境变化了一点，一般他们是不太适应的，是会淘汰的。但我们完全这样考虑是不恰当的，因为生物是会变异的。基因变异是有概率的，有些生物的基因变异概率大一些，有些生物的基因变异概率小一些。 2.性别的决定
多年来关于性别的决定一直有两大派别。一派主张“环境决定性别”，另一派主张“遗传决定性别”。前者认为孕妇所处的环境、饮食特点和精神状况等均可影响胎儿性别的形成，这里仅介绍遗传决定性别的理论。
（1）染色体决定性别论
这个理论认为性染色体决定男女的性别。人的正常核型中，XY性染色体决定了正常男性的性别发育；而XX决定了正常女性的性别发育。
在亲代的生殖细胞形成过程中，经过减数分裂，两条性染色体彼此分离，男性产生两种类型的精子——含X染色体的精子和含Y染色体的精子。女性则只产
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一种含X染色体的卵细胞。受精时，如果是含X的精子与卵子结合，就产生具有XX的受精卵并发育成女性；如果是含Y的精子与卵子结合，就产生具有XY的受精卵并发育成为男性。这说明男女的性别在受精卵形成时就已确定。由于男性可产生数量相等的X精子与Y精子，加之它们与卵子结合的机会相等，所以每次生男生女的概率是相等的。在整个人群中男女性别之比大致1∶1。
（2）基因决定性别论
在人类有极少数情况下，核型为46，XY者身体检查完全是正常女性，而46，XX核型的人身体检查是正常男性。这样，染色体决定性别的学说就不能解释这一特殊现象了。于是有人提出“基因决定性别论”。
20世纪70年代后期Wachtel等经研究提出，在人类Y染色体的短臂上存在一种H－Y抗原基因，其产物是一种分子量为18000的疏水蛋白，称为H－Y抗原，在胚胎发育过程中，H－Y抗原对性腺具有定向作用，它能使具有向两性分化潜能的生殖嵴分化成睾丸，所以H－Y抗原基因又称睾丸决定因子，有H－Y抗原（genital ridge）存在就有睾丸的发育，没有H－Y抗原存在，生殖嵴就会自然地发育成卵巢，再进一步发育出女性的内外生殖器。即该学说认为性别的决定取决于H－Y抗原基因——TDF的有无，国外有人已克隆了TDF的可编码的锌指状蛋白候补基因ZFY，在女性则为ZFX。决定性别基因的位点在男性为Yp11.32，在女性为Xp21.3。由于这种基因在性分化中起决定作用，所以叫“基因决定性别论”。核型46，XY为女性者是因为她的Y染色体上没有睾丸决定因子——TDF基因。
目前染色体决定性别论已逐渐被基因决定性别论所代替。
三．材料与方法
材 料：人(Homo sapiens)体口腔上皮细胞 方 法: 方法（一）
1．口腔粘膜细胞Barr氏小体显示方法
（1）取材: 受检查者用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签从口腔两侧颊部刮取粘膜，第一次刮取物弃去，将第二次、第三次刮取物涂在干净的载玻片上。 （2）固定: 滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或直接用乙醇）固定20～30min，空气干燥，或以酒精灯外焰烤干，注意材料不可过热加温。 （3）染色制片: 滴加1～2滴改良品红于室温下染色10～20min（勿使干燥），加上盖片，用吸水纸轻轻擦拭干载玻片上的染液，垫上滤纸用手指轻轻加压即可。
（4）镜检：并在高倍或油镜下观察。在制作的玻片标本中，选择细胞轮廓清楚、染色清晰，核大，核质呈均匀细网状的细胞100个，统计巴氏小体的频率(可与男性细胞对照观察)，并在高倍镜或油镜下观察。 2．发根毛囊细胞Barr氏小体显色方法
（1）取材 ：取带有发根的头发，长2—3cm，围绕发根部的1圈长2—3mm的白色物体，即是毛囊细胞团，将其放置于载玻片上。
（2）固定 ：在毛囊细胞处滴加一滴浓盐酸和95％乙醇1：1的混合液。约10min以后，可使毛囊细胞得到充分软化。
（3）染色：以清水冲洗2-3遍，将酸解液冲洗干净。拿起上述发根的梢部，将其
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上毛囊细胞轻轻蹭于另一干净载破片上即可达到转移的目的。
（4）制片 ：滴加1滴染液于待测细胞上，注意染液不可过多，以免细胞流失。约10min后，加盖玻片即可进行观察。 注意事项 ：
若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。另外，l根发根的毛囊细胞可以转移到3—4张载片上，以达到充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清晰的单层涂布细胞，便于观察统计。 （5）观察：
巴氏小体为女性细胞中所特有的染色体结构，是l条X染色体呈异固缩状态所形成，各实验室所统计的观察率不尽相同，从30％一50％不等，有些实验室中在男性的细胞中发现X小体有2%的出现率，但小体结构不规范、典型。巴氏小体常位于核膜内侧。直径为lμm左右，其形状有微凸形、三角形、卵形、短棒形和双球形等。观察时需注意巴氏小体与细胞的比例。
正常女性细胞中仅可观察到1个巴氏小体，而正常男性细胞中无巴氏小体或仅在个别细胞中有不典型的巴氏小体存在 方法（二）
1.取材：用牙签刮少许口腔粘膜细胞
2.涂片：将刮取物均匀地涂在干净的载玻片上，使成一薄层，空气中干燥。 3.固定：卡诺固定液（新配制，冰乙酸：乙醇=1：3）中固定15～20分钟，取出自然晾干。
4.酸解：在载玻片上滴加5mol/L盐酸，处理2～3分钟，清水洗涤。 5.细胞染色 ：滴加几滴甲苯胺蓝染色液染色30分钟，染色结束后，用清水洗掉浮色，空气中自然干燥。
6.显微镜观察（男性有巴氏小体的细胞<1%，而女性则高达30%） 方法（三）
l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。
2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。气干。
3．染色：玻片在蒸馏水中洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。水洗。
4．镜检、气干后即可镜检。若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。 方法（四）
1 取材 口腔粘膜细胞，受检查者用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签从口腔两侧颊部刮取粘膜，第一次刮取物弃去，将第二次、第三次刮取物涂在干净的载玻片上。
2 固定 口腔上皮制片干后滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或乙醇）固定20～30min，空气干燥。
3 染色制片 滴加1～2滴醋酸地衣红于室温下染色10～20min（勿使干燥），加上盖片，垫上滤纸用手指轻轻加压后镜检（若不镜检，待干后立即放入95%乙醇中30分钟以上，置冰箱中保存）。 发根毛囊细胞制片：发根细胞的染色可直接在材料上加一滴醋酸地衣红染料，拨掉毛囊弃毛干，再加一滴染液后盖上盖玻片，然后用文火微热，静置5min后盖一滤纸压片。或者在材料上滴一滴45％乙酸（或5mol/L HCl）解离5min后，吸
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