内容发布更新时间 : 2024/11/18 16:43:50星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
实验22过氧化物酶活性的测定 过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。 一、原理 在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 马铃薯块茎。 (二)仪器设备 722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。 (三)试剂 (1)0.05 mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。 (2)0.05 mo/L愈创木份溶液。 (3) 2%H202。 (4)20%三氯乙酸。 三、实验步骤 (一)酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10 min,上清被转人25 mL,容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 (二)过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液; 1.0ml.2%H2O2 ； 1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。 四、结果计算 以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。 1 / 12
过氧化物酶活性=???470×??????×????×0.01×??[u/（g.min）] 式中:?A470为反应时间内吸光度的变化 :W为马铃薯鲜重.g；t为反应时间，mins；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，mL。 实验24超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 （氮蓝四唑光化还原法） 一、原理 超氧物歧化酶(Superxide dismtae, SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离?子自由基(O?2的酶,它催化下列反应:2O2+2H+ H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生??O?2, O2可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 水稻或小麦叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。 (三)试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮） （2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 2 / 12
（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 （5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。 三、实验步骤 酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5--2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。 显色反应 取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。 表39-1 各溶液加入量 试 剂（酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶 液 蒸馏水 总体积 用量(ml) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 终浓度（比色时） 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 2支对照以缓冲液代替酶液 SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性： SOD总活性=(Ack?AE)×V0.5×??×????×?????? 式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示； 3 / 12