内容发布更新时间 : 2024/12/26 2:55:37星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
抗蛇毒血清的制备
摘要：目的 对传统抗蛇毒血清精制方法进行改进, 研制出一种高收率、高纯度、低成本、易于保存与使用的新型抗蛇毒血清的制备方法。 方法 先提取抗蛇毒血清的IgG 后酶解分段盐析得F( ab,)2 片段, 通过疏水层析进一步纯化F( ab,)2 , 然后脱盐冻干。 结果 新方法制备的蛇毒F( ab,)2 纯度达90%以上, 收率60%以上。结论 采用新方法制备的F( ab,)2 纯度和收率有很大提高, 在其它试剂不增加的情况下, 降低了一半的硫酸。铵用量, 生产周期由原来72 h 缩短到48 h。
关键词： 精制抗蛇毒血清; 生产工艺
自1896 年Calmet te 首先研制成临床用的抗蛇毒血清, 并且奠定了抗蛇毒血清治疗蛇伤中毒的基础, 迄今抗蛇毒血清的使用已有一百多年的历史, 直至目前, 国内外治疗蛇伤
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中毒, 仍以抗蛇毒血清为首选的特效药物 。我国抗蛇毒血清的精制方法2000 版的《中国
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生物制品规程》采用的是胃酶消化-硫酸铵盐析的工艺 , 与以往的浓缩制品相比, 由于采
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用了胃酶消化切割, 收集的是有活性的分子量减小到原来一半左右的F( ab)2 片段, 从而
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降低了制品的过敏反应率 。但目前采用的生产工艺仍存在一些问题, 具体表现在: 作为一个注射制剂纯度要求过低( 60% ) 、收率也较低、无冻干工艺, 使制品在保存运输上受一定限制。我们针对以上问题对抗蛇毒血清的生产工艺进行了改进, 以提高产品纯度和收率, 新增加了冻干工艺并降低了生产周期。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1. 1 蛇毒 分别从广东、广西、浙江、福建、江西等养蛇厂购进我国主要的9 种干燥蛇毒。
1．1．2 免疫用马 选择3~ 10 岁云南矮种健壮马匹, 按药典要求进行检疫合格后使用。 1．1. 3 仪器与试剂 硫酸铵, 分析纯; 低分子量标准蛋白, 上海丽珠东风生物技术有限公司; 胃蛋白酶( 1 B 3000) , 上海华舜生物工程有限公司; PhenylSepharo se FF, Sephadex G-25 为GE 公司产品;AKTA ex plorer 蛋白纯化系统, GE 公司产品; H etoFD3 冻干机, 丹麦产。
1．2 方法 1．2.1 马匹免疫 将已除菌透析的蛇毒与配好的无菌油佐剂等量混合后用乳化器乳化, 其
抗原浓度分为01 2 mg/ ml 和1 mg/ ml。( 1) 前期免疫。马匹在进行蛇毒免疫前用浓缩破伤风类毒素进行2 次前期免疫, 以防止后期蛇毒免疫引起的破伤风。( 2) 基础免疫。小剂量蛇毒抗原( 每匹01 1~ 01 5 mg ) 于马背部注射2 针, 每针间隔3 周。( 3) 超免疫。基础免疫后第2 周测定马的血清效价, 当有明显抗体应答反应后进行超免疫, 超免疫剂量从每匹马1 mg 分5~ 10 次加大到10 mg, 每次免疫间隔2 周, 免疫部位为皮下和肌肉、穴位交替进行。
1．2. 2 采血 试血效价按1 m L 免疫血清与不同稀释度的眼镜王蛇蛇毒溶液等体积混合, 于37 ℃ 结合45 m in后接种小白鼠,雌雄各半,ip, 每个稀释度注射4 只,记录72 h 小鼠死亡情况, 以能保护小鼠全部存活的一组作为其试血效价。1 m L 免疫血浆能中和1 m g眼镜王蛇毒后, 采血, 离心分离血浆, 保存于一20℃ , 累积几次血浆后, 混合并制备
1．2.3 抗蛇毒血清精制 ( 1) IgG 提取。每100ml 血浆磁力搅拌下加入固体硫酸铵, 使硫酸铵终浓度为50%, 搅拌30 min 后离心, 取沉淀, 加入原血浆体积的注射用水, 搅拌至溶解, 加入固体硫酸铵,使硫酸铵终浓度为33%, 搅拌至固体硫酸铵完全溶解后离心, 取沉
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淀, 沉淀加注射用水适量, 搅拌至完全溶解、透析后离心, 取上清即为IgG 溶液 。
,
( 2)F( ab)2 制备。上述IgG 溶液按01 11 g/ 1000 ml( 原血浆体积) 加入胃酶, 6 mol/ L
..
HCl 调节pH 3.5,31C 酶解4~ 6 h, 5 mo l/ L NaOH 调节pH 5.2, 置57C 保温30 min, 待
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温度降至45C 以下后, 离心,上清为F( ab)2 。( 3) F( ab)2纯化。上述F( ab)2用硫酸铵调节电导后上Pheny-l Sepharose( low-sub)柱, 用11 2 mol/ L( NH4)2SO4 + 50 mmo l/ L 磷酸钠缓冲液( pH 7. 0) 淋洗后, 用注射用水梯度洗脱, 分别收集各洗脱峰, 并测定其F( abc)
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2纯度。( 4) 抗血清效价测定。参照精制抗蛇毒血清制备及检定规程 。( 5) SDS 聚丙烯
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酰胺凝胶电泳及分子量测定。电泳方法参照分子克隆实验指南.蛋白纯度用Bio一R ad G el doc EQ 凝胶成像系统对电泳结果进行图像采集后, 使用Quantity One 4.4 凝胶分析软件得出。
2 结果
2．1 IgG 提取结果 在IgG 提取过程中, 由SDSPAGE电泳图( 图1) 可看出, IgG 收率较高, 基本没丢失, IgG 的纯度在85%左右。
图1 IgG 各步提取结果
1．原血浆; 2. 50%( NH4)2SO4 上清; 3. 50%( NH4)2SO4 沉淀; 4. 33%( NH4)2SO4 上清;5. 33%( NH4)2SO4 沉淀; 6. 透析液; 7. 标准蛋白。
2.2 酶解及F( abc)2 制备结果 由SDS-PA GE 电泳可看出, 胃酶消化5 h 左右IgG 已基本
。,
完全切开,57C 加热30 min 后, 大部分的pFcc片段去除干净,此时的F( ab)2纯度可达到60%左右( 图2) 。