
高效液相色谱常见问题与解?/p>
1
何谓反相柱、正相柱?/p>
答:
“
反相
”
?/p>
“
正相
”
的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相?/p>
谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动
相极性与固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为
反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为?/p>
流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义?/p>
由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动
相极性?/p>
C18(
硅胶键合十八烷基硅烷
)
?/p>
C8(
硅胶键合辛基硅烷
)
?/p>
PH(
硅胶键合苯基硅烷
)
等色谱柱,由于固
定相极性极低,
比目前已知的任何流动相的极性都要低?/p>
因而是标准的反相柱?/p>
Silica(
硅胶
)
?/p>
NH2(
硅胶?/p>
合氨丙基硅烷
)
具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些?/p>
定相?/p>
因而是标准的正相柱?/p>
CN(
硅胶键合腈丙?/p>
)
的极性适中,当流动相极性超?/p>
CN
时,
它属于反相柱?/p>
反之则是正相柱?/p>
2
色谱柱规格对分析结果会产生何种影响?
答:色谱柱内径决定载样量,载样量与内径的平方成正比;色谱柱长度与塔板数成正比,与柱压成正比;
粒径影响涡流扩散相,粒径越小涡流扩散相越小,柱效越高,粒径与柱效近似成反比;粒径越小,压力也
越大,压力与粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制,当孔径为分析物尺寸的
5
倍以?/p>
时,分析物才能顺利通过孔隙,孔径处?/p>
60~120 Å
的色谱柱适用于相对分子量小于
10000
的分?/p>
物,孔径?/p>
300 Å
的色谱柱可以满足分子量处?/p>
10000
以上的大分子化合物分析?/p>
3
液相色谱分析中如何才能提高分离度?/p>
答:下式为分离度计算公式
N
:柱?/p>
(Efficiency)
反映色谱柱性能,柱效越高,分离度越好。在其他条件恒定的情况下,塔板数增加一
倍,分离度仅提高
40%
。操作中,可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度:其一,使用长柱或?/p>
柱串联,但也会使分离时间大大延长;其二,使用细粒径填料的色谱柱,但这需要耐更高压力的液相色谱
系统。相比之下后者更为可取?/p>
α
?/p>
选择?/p>
(selectivity)
是指色谱?/p>
-
流动相体系分离两个化合物的能力?/p>
选择性主要与固定相?/p>
流动
相组成以及柱温等因素有关,与保留值也密切相关,其中固定相和流动相组成影响较大。以最常见的反?/p>
模式为例,反相柱
(
包括
C18
?/p>
C8
?/p>
PH
?/p>
)
是以分配作用对化合物进行保留的,不同化合物的分离是基?/p>
它们在键合相与流动相中分配系数的差异?/p>
如果两种化合物的水溶性?/p>
在烷?/p>
-
水体系的分配系数等方面存
在明显差异,那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离?/p>
PH
柱对具有苯环的化合物具有特殊保留?/p>
正相模式下,硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用,对化合物的基?/p>
具有选择性,常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面,降低流动相的洗脱强度通常可以
增大分离度;而有机溶剂类型也会影响分离,比如反相条件下,乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异,这
种差异需要在实践中摸索,但无论如何,多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能?/p>