叶绿?/p>
a,b
含量测定
[实验目的]
熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿?/p>
a
?/p>
b
的方法及其计算?/p>
[实验原理]
在叶绿素
a
?/p>
b
的吸收光谱曲线中,红波波长范围内,叶绿素
a
的最大吸收峰?/p>
663nm
,叶绿素
b
的最大吸
收峰?/p>
645nm
。吸收曲线彼此又有重叠?/p>
根据
Lambert
?/p>
Beer
定律,最大吸收峰不同的两个组分的混合液,它们的浓?/p>
C
与光密度
OD
之间有如下关系:
OD
1
?/p>
Ca
·
ka
1
+Cb
·
kb
1
(1)
OD
2
?/p>
Ca
·
ka
2
+Cb
·
kb
2
(2)
Ca
为组?/p>
a
的浓度(
g/L
?/p>
Cb
为组?/p>
b
的浓度(
g/L
?/p>
OD
1
为在波长
λ
1
(即组分
a
的最大吸收峰波长)时,混合液的光密度
OD
值?/p>
OD
2
为在波长
λ
2
(即组分
b
的最大吸收缝波长)时,混合液的光密度
OD
?/p>
?/p>
ka
1
?/p>
kb
1
?/p>
ka
2
?/p>
kb
2
分别为组?/p>
a
?/p>
b
的比吸收系数,即组分
a
?/p>
b
)的浓度为(
1g/L
)时,其在相应波?/p>
?/p>
λ
1
?/p>
λ
2
?/p>
?/p>
的光密度
OD
值?/p>
叶绿?/p>
A
?/p>
B
?/p>
80%
丙酮溶液,当浓度?/p>
1
时,比吸收系?/p>
K
值如下表?/p>
波长
/nm
叶绿?/p>
a
叶绿?/p>
b
663
82.04
9.27
645
16.75
45.60
将表中数值代入上式(
1
?/p>
?/p>
?/p>
2
)并整理的:
Ca=0.0127OD
663
-0.00269OD
645
Cb=0.0229OD
645
-0.00468OD
663
若把
Ca
?/p>
Cb
的浓度单位从原来?/p>
g/L
改为
mg/L
,则上式可改写为下列形式?/p>
Ca=12.7OD
663
-2.69OD
645
(3)
Cb=22.9OD
645
-4.68OD
663
(4)
Ct=Ca+Cb=8.02OD
663
+20.21OD
645
(5)
Ct
为叶绿素总浓度,单位?/p>
g/L
?/p>
利用?/p>
3
?/p>
?/p>
?/p>
4
?/p>
?/p>
?/p>
5
)式即可计算出叶绿素
A
?/p>
B
及总叶绿素的浓度(
g/L
?/p>
?/p>
[器材与试剂?/p>
1.
实验仪器:高级型分光光度计,离心机,台天平,剪刀,研钵,漏斗,移液管
2.
实验试剂:丙酮,碳酸?/p>
3.
实验材料:植物叶?/p>
[实验步骤]
1.
色素的提取:
取新鲜叶片,
剪去粗大的叶脉并剪成碎块?/p>
称取
0.5G
放入研钵中加纯丙?/p>
5ML
?/p>
少许碳酸钙和石英砂,
研磨成匀浆,再加
80%
丙酮
5ML
,将匀浆转入离心管,并用适量
80%
丙酮洗涤研钵,一并转入离心管,离心后弃沉淀,上?/p>
液用
80%
丙酮定容?/p>
20ML
?/p>
2.
测定光密度:取上述色素提取液
1ml
,加
80%
丙酮
4ml
稀释和转入比色杯中,以
80%
丙酮为对照,分别测定
663nm
?/p>
645nm
处的光密度值?/p>
3.
按公式分别计算色素提取液中叶绿素
A
?/p>
B
及叶绿素总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量?/p>
[注意事项]
1.
由于植物子叶中含有水分,故先用纯丙酮进行提取,以色素提取液中丙酮的最终浓度近?/p>
80%
?/p>
2.
由于叶绿?/p>
A
?/p>
B
的吸收峰很陡,仪器波长稍有偏差,就会使结果产生很大的误差,因此最好能用波长较正确的高
级型分光光度计?/p>
[实验作业]
1.
试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素
A
和叶绿素
B
的比值有无不同?/p>
2.
分光光度法和比色法有何不同?
3.
叶绿?/p>
A
和叶绿素
B
在红光区和蓝光区都有最大吸收峰?/p>
能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿?/p>
A
和叶绿素
B
的定量分析,为什么?