实验?/p>
碱性蛋白酶活力的测?/p>
一、实验原?/p>
以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力?/p>
酪蛋白经蛋白酶作用后?/p>
会降解成
相对分子质量较小的肽和氨基酸?/p>
在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,
相对分子
质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来?/p>
相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶?/p>
中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采?/p>
Folin
法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力?/p>
二、试剂和仪器
试剂?/p>
0.1mol/L
碳酸?/p>
-
碳酸氢钠缓冲液(
pH10
)?/p>
5%
三氯醋酸?/p>
1%
酪蛋白溶
液(称取
5g
酪蛋白置?/p>
500mL
0.1mol/L
碳酸?/p>
-
碳酸氢钠缓冲液(
pH10
)中?/p>
加热使其溶解)?/p>
0.4mol/L
碳酸钠溶液?/p>
100μg/mL
酪氨酸溶液?/p>
Folin
试剂,稀
?/p>
3
倍使?/p>
仪器:水浴锅?/p>
721
分光光度计(含比色皿)、秒表、常规玻璃仪?/p>
三、实验步?/p>
1
、酶液的萃取
称取
1g
粗酶制剂置于研钵中,
加少量缓冲液一起研磨,
然后定容?/p>
100mL
?/p>
从容量瓶中取?/p>
5mL
酶液(视酶活而定)再定容?/p>
100mL
,稀释后的酶液经?/p>
纸过滤后得到澄清的酶液?/p>
2
、酶活力的测?/p>
样品管:
取不同量的酶?/p>
?/p>
0.1~1.0mL
?/p>
0.2mL
?/p>
0.4mL
?/p>
0.6mL
?/p>
?/p>
?/p>
0.1mol/L
碳酸?/p>
-
碳酸氢钠缓冲液(
pH10
)(对应?/p>
0.8mL
?/p>
0.6mL
?/p>
0.4mL
)补足体积到
1.0mL
?/p>
然后在每个样品管中再加入
1mL
预先?/p>
40
℃保温的
1%
酪蛋白溶液,
?/p>
匀,在
40
℃准确保?/p>
10min
,加?/p>
2mL 5%
三氯醋酸溶液,迅速摇匀,于室温?/p>
置半小时?/p>
空白管:
先在每支试管中各加入
1.0mL 1%
酪蛋白溶液和
2.0mL 5%
三氯醋酸
溶液,摇匀后,再加?/p>
1.0mL
的酶液,酶液浓度分别与对应的样品管相同,?/p>
40
℃下准确保温
10min
,以下操作同样品管?/p>
将酶反应混合物过滤后收集滤液,在
1mL
滤液中加
5mL 0.4mol/L
碳酸钠溶