WB
经验总结
来源?/p>
丁香园论?/p>
?/p>
由张慧慧(长?/p>
湘雅附二)推?/p>
?/p>
dxy
好多年了?/p>
这些年陆陆续续回复了一些帖子,
可是回来回去?/p>
发现大家提的问题?/p>
还是那么几个?/p>
没有从根本上有所提高?/p>
确实出乎意料?/p>
看过很多总结经验的帖子,不知?/p>
该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益?/p>
实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成?/p>
WB
?/p>
战指南?/p>
,欢迎行家批评指正?/p>
首先,摆摆自己的经验。鄙人做
WB
?/p>
8
?/p>
9
年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶?/p>
文章嘛,凑数的单篇有?/p>
24+
,一作单?/p>
15+
(系国内完成;注:当年的
IF
,现在逐年递减
没个标准?/p>
?/p>
其次,由于一些机缘的因素,在实验?/p>
WB
体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说?/p>
话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享?/p>
再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何
缩短操作时间?/p>
使实验进行的更有效率也是我们所追求的,
因此本文会针对两个普遍采用的
却可以看成浪费时间的操作?/p>
Bradford
法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的
WB
操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人?/p>
的?/p>
话不多废,开始:
样品制备?/p>
变性条件—?/p>
SDS LB
直接裂解?/p>
用常温或者高温预热过
(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化?/p>
但容易遗忘,
LB
久煮某些性质会改变)?/p>
1*SDS
LB
(或者略?/p>
1.5*
)直接加到细胞或者组织上并煮样?/p>
通常
6
孔板细胞
80%
以上密度,需
200ul
,其他按平板面积比类推。通常条件下,
SDS LB
?/p>
是过量的(因此不一定要严格参?/p>
SDS LB
稀释比?/p>
;如?/p>
SDS LB
不够,样品核酸、蛋白浓?/p>
过高时,煮样后会发现
tip
吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住
tip
。这时候常规做
法有两种?/p>
1.
再煮
5min
。常规煮样时?/p>
3
-
5min
,样品过浓时就煮
10min
?/p>
2.
如果
10min
?/p>
样后,仍然吸不起来,才适当增加
SDS LB
,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若?/p>
长,蛋白会凝固,此时以失去继?/p>
WB
的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀?/p>
水分层)
此方法的缺点?/p>
SDS LB
煮过的样品如果用来做
IP
,需要特殊方法,
因此?/p>
这种制备方法
制备的样品有使用局限?/p>
非变性裂解法
(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)
裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用?/p>
俺前
boss nature
文章上的
裂解液配?/p>
是:
20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,
1.5mM MgCl2, 0.5% NP
-
40 and protease inhibitors (20
μ
g/ml leupeptin, 10
μ
g/ml pepstatin A
and 10
μ
g/ml aprotinin)
(此裂解液可用于抽提核蛋白)
,其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,
其实?/p>
0.5mM PMSF
替代这三种就好了?/p>
如果还要做磷酸化蛋白?/p>
?/p>
1mM Na3VO4
(现加现
用)
?/p>
10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta
-
GP
?/p>
此方法的
优点
?/p>
NaCl
浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后