新建
上传
首页
助手
最?/div>
资料?/div>
工具

WB

经验总结

 

来源?/p>

丁香园论?/p>

?/p>

由张慧慧(长?/p>

 

 

湘雅附二)推?/p>

 

 

?/p>

dxy

好多年了?/p>

这些年陆陆续续回复了一些帖子,

可是回来回去?/p>

发现大家提的问题?/p>

还是那么几个?/p>

没有从根本上有所提高?/p>

确实出乎意料?/p>

看过很多总结经验的帖子,不知?/p>

该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益?/p>

实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成?/p>

WB

?/p>

战指南?/p>

,欢迎行家批评指正?/p>

 

首先,摆摆自己的经验。鄙人做

WB

?/p>

8

?/p>

9

年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶?/p>

文章嘛,凑数的单篇有?/p>

24+

,一作单?/p>

15+

(系国内完成;注:当年的

IF

,现在逐年递减

没个标准?/p>

?/p>

 

其次,由于一些机缘的因素,在实验?/p>

WB

体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说?/p>

话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享?/p>

 

再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何

缩短操作时间?/p>

使实验进行的更有效率也是我们所追求的,

因此本文会针对两个普遍采用的

却可以看成浪费时间的操作?/p>

Bradford

法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的

WB

操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人?/p>

的?/p>

 

话不多废,开始:

 

 

样品制备?/p>

 

变性条件—?/p>

SDS LB

直接裂解?/p>

 

用常温或者高温预热过

(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化?/p>

但容易遗忘,

LB

久煮某些性质会改变)?/p>

1*SDS 

LB

(或者略?/p>

1.5*

)直接加到细胞或者组织上并煮样?/p>

通常

6

孔板细胞

80%

以上密度,需

200ul

,其他按平板面积比类推。通常条件下,

SDS LB

?/p>

是过量的(因此不一定要严格参?/p>

SDS LB

稀释比?/p>

;如?/p>

SDS LB

不够,样品核酸、蛋白浓?/p>

过高时,煮样后会发现

tip

吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住

tip

。这时候常规做

法有两种?/p>

1. 

再煮

5min

。常规煮样时?/p>

3

-

5min

,样品过浓时就煮

10min

?/p>

2.

如果

10min

?/p>

样后,仍然吸不起来,才适当增加

SDS LB

,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若?/p>

长,蛋白会凝固,此时以失去继?/p>

WB

的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀?/p>

水分层)

 

此方法的缺点?/p>

SDS LB

煮过的样品如果用来做

IP

,需要特殊方法,

因此?/p>

这种制备方法

制备的样品有使用局限?/p>

 

 

非变性裂解法

(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)

 

裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用?/p>

 

俺前

boss nature

文章上的

裂解液配?/p>

是:

20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 

1.5mM MgCl2, 0.5% NP

-

40 and protease inhibitors (20

μ

g/ml leupeptin, 10

μ

g/ml pepstatin A 

and 10 

μ

g/ml aprotinin)

(此裂解液可用于抽提核蛋白)

,其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,

其实?/p>

0.5mM PMSF

替代这三种就好了?/p>

如果还要做磷酸化蛋白?/p>

?/p>

1mM Na3VO4

(现加现

用)

?/p>

10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta

-

GP

?/p>

 

此方法的

优点

?/p>

NaCl

浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后

Ͼλ
新建
上传
首页
助手
最?/div>
资料?/div>
工具

WB

经验总结

 

来源?/p>

丁香园论?/p>

?/p>

由张慧慧(长?/p>

 

 

湘雅附二)推?/p>

 

 

?/p>

dxy

好多年了?/p>

这些年陆陆续续回复了一些帖子,

可是回来回去?/p>

发现大家提的问题?/p>

还是那么几个?/p>

没有从根本上有所提高?/p>

确实出乎意料?/p>

看过很多总结经验的帖子,不知?/p>

该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益?/p>

实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成?/p>

WB

?/p>

战指南?/p>

,欢迎行家批评指正?/p>

 

首先,摆摆自己的经验。鄙人做

WB

?/p>

8

?/p>

9

年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶?/p>

文章嘛,凑数的单篇有?/p>

24+

,一作单?/p>

15+

(系国内完成;注:当年的

IF

,现在逐年递减

没个标准?/p>

?/p>

 

其次,由于一些机缘的因素,在实验?/p>

WB

体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说?/p>

话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享?/p>

 

再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何

缩短操作时间?/p>

使实验进行的更有效率也是我们所追求的,

因此本文会针对两个普遍采用的

却可以看成浪费时间的操作?/p>

Bradford

法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的

WB

操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人?/p>

的?/p>

 

话不多废,开始:

 

 

样品制备?/p>

 

变性条件—?/p>

SDS LB

直接裂解?/p>

 

用常温或者高温预热过

(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化?/p>

但容易遗忘,

LB

久煮某些性质会改变)?/p>

1*SDS 

LB

(或者略?/p>

1.5*

)直接加到细胞或者组织上并煮样?/p>

通常

6

孔板细胞

80%

以上密度,需

200ul

,其他按平板面积比类推。通常条件下,

SDS LB

?/p>

是过量的(因此不一定要严格参?/p>

SDS LB

稀释比?/p>

;如?/p>

SDS LB

不够,样品核酸、蛋白浓?/p>

过高时,煮样后会发现

tip

吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住

tip

。这时候常规做

法有两种?/p>

1. 

再煮

5min

。常规煮样时?/p>

3

-

5min

,样品过浓时就煮

10min

?/p>

2.

如果

10min

?/p>

样后,仍然吸不起来,才适当增加

SDS LB

,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若?/p>

长,蛋白会凝固,此时以失去继?/p>

WB

的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀?/p>

水分层)

 

此方法的缺点?/p>

SDS LB

煮过的样品如果用来做

IP

,需要特殊方法,

因此?/p>

这种制备方法

制备的样品有使用局限?/p>

 

 

非变性裂解法

(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)

 

裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用?/p>

 

俺前

boss nature

文章上的

裂解液配?/p>

是:

20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 

1.5mM MgCl2, 0.5% NP

-

40 and protease inhibitors (20

μ

g/ml leupeptin, 10

μ

g/ml pepstatin A 

and 10 

μ

g/ml aprotinin)

(此裂解液可用于抽提核蛋白)

,其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,

其实?/p>

0.5mM PMSF

替代这三种就好了?/p>

如果还要做磷酸化蛋白?/p>

?/p>

1mM Na3VO4

(现加现

用)

?/p>

10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta

-

GP

?/p>

 

此方法的

优点

?/p>

NaCl

浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后

">
新建
上传
首页
助手
最?/div>
资料?/div>
工具

WB

经验总结

 

来源?/p>

丁香园论?/p>

?/p>

由张慧慧(长?/p>

 

 

湘雅附二)推?/p>

 

 

?/p>

dxy

好多年了?/p>

这些年陆陆续续回复了一些帖子,

可是回来回去?/p>

发现大家提的问题?/p>

还是那么几个?/p>

没有从根本上有所提高?/p>

确实出乎意料?/p>

看过很多总结经验的帖子,不知?/p>

该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益?/p>

实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成?/p>

WB

?/p>

战指南?/p>

,欢迎行家批评指正?/p>

 

首先,摆摆自己的经验。鄙人做

WB

?/p>

8

?/p>

9

年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶?/p>

文章嘛,凑数的单篇有?/p>

24+

,一作单?/p>

15+

(系国内完成;注:当年的

IF

,现在逐年递减

没个标准?/p>

?/p>

 

其次,由于一些机缘的因素,在实验?/p>

WB

体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说?/p>

话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享?/p>

 

再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何

缩短操作时间?/p>

使实验进行的更有效率也是我们所追求的,

因此本文会针对两个普遍采用的

却可以看成浪费时间的操作?/p>

Bradford

法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的

WB

操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人?/p>

的?/p>

 

话不多废,开始:

 

 

样品制备?/p>

 

变性条件—?/p>

SDS LB

直接裂解?/p>

 

用常温或者高温预热过

(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化?/p>

但容易遗忘,

LB

久煮某些性质会改变)?/p>

1*SDS 

LB

(或者略?/p>

1.5*

)直接加到细胞或者组织上并煮样?/p>

通常

6

孔板细胞

80%

以上密度,需

200ul

,其他按平板面积比类推。通常条件下,

SDS LB

?/p>

是过量的(因此不一定要严格参?/p>

SDS LB

稀释比?/p>

;如?/p>

SDS LB

不够,样品核酸、蛋白浓?/p>

过高时,煮样后会发现

tip

吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住

tip

。这时候常规做

法有两种?/p>

1. 

再煮

5min

。常规煮样时?/p>

3

-

5min

,样品过浓时就煮

10min

?/p>

2.

如果

10min

?/p>

样后,仍然吸不起来,才适当增加

SDS LB

,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若?/p>

长,蛋白会凝固,此时以失去继?/p>

WB

的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀?/p>

水分层)

 

此方法的缺点?/p>

SDS LB

煮过的样品如果用来做

IP

,需要特殊方法,

因此?/p>

这种制备方法

制备的样品有使用局限?/p>

 

 

非变性裂解法

(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)

 

裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用?/p>

 

俺前

boss nature

文章上的

裂解液配?/p>

是:

20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 

1.5mM MgCl2, 0.5% NP

-

40 and protease inhibitors (20

μ

g/ml leupeptin, 10

μ

g/ml pepstatin A 

and 10 

μ

g/ml aprotinin)

(此裂解液可用于抽提核蛋白)

,其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,

其实?/p>

0.5mM PMSF

替代这三种就好了?/p>

如果还要做磷酸化蛋白?/p>

?/p>

1mM Na3VO4

(现加现

用)

?/p>

10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta

-

GP

?/p>

 

此方法的

优点

?/p>

NaCl

浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后

Ͼλ">
Ͼλ
Ŀ

WB方法经验总结 - 百度文库
新建
上传
首页
助手
最?/div>
资料?/div>
工具

WB

经验总结

 

来源?/p>

丁香园论?/p>

?/p>

由张慧慧(长?/p>

 

 

湘雅附二)推?/p>

 

 

?/p>

dxy

好多年了?/p>

这些年陆陆续续回复了一些帖子,

可是回来回去?/p>

发现大家提的问题?/p>

还是那么几个?/p>

没有从根本上有所提高?/p>

确实出乎意料?/p>

看过很多总结经验的帖子,不知?/p>

该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益?/p>

实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成?/p>

WB

?/p>

战指南?/p>

,欢迎行家批评指正?/p>

 

首先,摆摆自己的经验。鄙人做

WB

?/p>

8

?/p>

9

年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶?/p>

文章嘛,凑数的单篇有?/p>

24+

,一作单?/p>

15+

(系国内完成;注:当年的

IF

,现在逐年递减

没个标准?/p>

?/p>

 

其次,由于一些机缘的因素,在实验?/p>

WB

体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说?/p>

话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享?/p>

 

再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何

缩短操作时间?/p>

使实验进行的更有效率也是我们所追求的,

因此本文会针对两个普遍采用的

却可以看成浪费时间的操作?/p>

Bradford

法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的

WB

操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人?/p>

的?/p>

 

话不多废,开始:

 

 

样品制备?/p>

 

变性条件—?/p>

SDS LB

直接裂解?/p>

 

用常温或者高温预热过

(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化?/p>

但容易遗忘,

LB

久煮某些性质会改变)?/p>

1*SDS 

LB

(或者略?/p>

1.5*

)直接加到细胞或者组织上并煮样?/p>

通常

6

孔板细胞

80%

以上密度,需

200ul

,其他按平板面积比类推。通常条件下,

SDS LB

?/p>

是过量的(因此不一定要严格参?/p>

SDS LB

稀释比?/p>

;如?/p>

SDS LB

不够,样品核酸、蛋白浓?/p>

过高时,煮样后会发现

tip

吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住

tip

。这时候常规做

法有两种?/p>

1. 

再煮

5min

。常规煮样时?/p>

3

-

5min

,样品过浓时就煮

10min

?/p>

2.

如果

10min

?/p>

样后,仍然吸不起来,才适当增加

SDS LB

,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若?/p>

长,蛋白会凝固,此时以失去继?/p>

WB

的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀?/p>

水分层)

 

此方法的缺点?/p>

SDS LB

煮过的样品如果用来做

IP

,需要特殊方法,

因此?/p>

这种制备方法

制备的样品有使用局限?/p>

 

 

非变性裂解法

(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)

 

裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用?/p>

 

俺前

boss nature

文章上的

裂解液配?/p>

是:

20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 

1.5mM MgCl2, 0.5% NP

-

40 and protease inhibitors (20

μ

g/ml leupeptin, 10

μ

g/ml pepstatin A 

and 10 

μ

g/ml aprotinin)

(此裂解液可用于抽提核蛋白)

,其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,

其实?/p>

0.5mM PMSF

替代这三种就好了?/p>

如果还要做磷酸化蛋白?/p>

?/p>

1mM Na3VO4

(现加现

用)

?/p>

10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta

-

GP

?/p>

 

此方法的

优点

?/p>

NaCl

浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后



ļ׺.doc޸Ϊ.docĶ

  • 2011ݹ񾭼úᷢչͳƹ
  • AS-9000Сϵͳ
  • 2015-2020йɫľҵгͶǰ - ͼ
  • (ز߻)ز߻
  • Сѧ꼶100⼰
  • ǻũҵҵ԰Ŀо뱨ģ
  • ıͺŴȫȫϸ32ҳ
  • ̰ͨһ
  • 꼶ѧϲ 1.2 ϵĵʾ̰ (°)θİ
  • ̰꼶²Ʒᵼѧ

վ

԰ Ͼλ
ϵͷ779662525#qq.com(#滻Ϊ@) ICP20003344-4