异硫氰酸?/p>
强用力的蛋白质变性剂?/p>
能迅速溶解蛋白质?/p>
导致细胞结构破碎?/p>
核蛋白由于其二级?/p>
构的破坏消失而迅速与核酸分离?/p>
胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂?/p>
在通常使用的蛋?/p>
质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍?/p>
它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态?/p>
?/p>
有强力的阴离子和阳离子基团,
它们可以形成较强的氢键?/p>
在还原剂存在的情况下?/p>
异硫?/p>
酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如
SDS
存在的情况下,可以破坏疏水作用?/p>
盐酸胍、尿?/p>
盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的
RNA
从富?/p>
RNase
的组织中提取出来?/p>
4-8M
可断裂氢键,有两种可能机制:
1
变性蛋白和盐酸胍?/p>
尿素优先结合,形成变性蛋
?/p>
-
变性剂复合物,当复合物被除去,从而引?/p>
N-D
反应平衡向右移动,随着变性剂浓度?/p>
加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;
2
盐酸胍、尿素对氨基
酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为
非极性残基的较好溶剂?/p>
使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,
盐酸胍?/p>
尿素引起?/p>
变性往往是不可逆的?/p>
高浓度尿素使蛋白质变性并抑制
Rnase
活?/p>
十二烷基肌氨酸钠
使蛋白质解体
变?/p>
巯基试剂
1
防止蛋白质或酶等(如辅酶
A
)分子中
SH
基团氧化成二硫键?/p>
2
在某些酶反应过程?/p>
维持体系的还原环境?/p>
DTT
?/p>
DDTE
、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于他是生?/p>
体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放?/p>
DNA
提取中,常使用巯基乙醇,
维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于
2%
?/p>
巯基乙醇
β
-
巯基乙醇的主要作用是破坏
RNase
蛋白质中的二硫键(肽和蛋白质分子中的
半胱氨酸
?/p>
基中的键)?/p>
1
还原蛋白质二硫键,使
Rna
酶变?/p>
2
抑制酚类氧化?/p>
若氧化,
核酸会变成灰黑色?/p>
苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二?/p>
键的断裂及导?/p>
RNA
?/p>
DNA
的交?/p>
3
保护蛋白质的巯基
蛋白质提取中需?/p>
巯基乙醇还原二硫键,?/p>
RNA
酶失?/p>
