内容发布更新时间 : 2025/7/12 10:13:12星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
不太好,做大蛋白(半干转仪也可以做大蛋白转膜,效率确实不如湿转,但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用)长时程(3hrs)转膜需要在4度冰柜或cold room进行;英国的产品,价格较高,公司不太出名国内不一定有代理,但质量和散热都非常好。
这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白,转膜效率最佳,但靡费试剂、溶液,对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转(下文会具体给出条件);半干转适合分子量较小的蛋白,省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢?习惯上认为150KDa以上为大蛋白,其他均属于小蛋白,当然这只是一个相对标准。因此,通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转,那么刚才提到的amersham半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义,何况还可以外加条件弥补;而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞,此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定因素。
湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆,有必要指出的是,实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想,通常这种缓冲液可以反复使用多次(30V,~35V附近的时候,保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK的,即使整张大板胶室温电转3hr以后,最大电压仍为18V(因此足见其散热性能的优良)。注明:以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的,这里面有一个很有趣的问题。尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高(但NC带负电性,理论上它的吸附量应该更高,所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高),但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜,因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜,造成转膜过度的假象(除可考虑提升甲醇浓度至25%外,也可以考虑增加marker的上样量);NC膜没有这种问题,所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs,电流控制在200-300mA(16cm*9cm大胶300mA,如果胶面积小很多可以考虑降低,实际上相当于2.5-3mA/cm2左右)。NC膜唯一不如PVDF膜的地方,在我看来是它的强度:干燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题,将NC成分涂在另一种介质的表面,这种膜的支持强度和PVDF膜类似,但转膜效率稍差于纯NC膜,且有明显的正反面;因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外,20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔径的转印膜,但也不是一定必须。
对于大蛋白转印,很多书本建议采用低浓度胶,如6% SDS-PAGE。但实际操作发现,6%太软,制作转印三明治的操作非常麻烦;且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近,而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右,除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶,否则需要同时跑两块胶,因此也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶(底边36KDa)都可以胜任,可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。
转膜最好在低温进行(高温会局部溶胶或降低转膜效率),尽管很多半干转仪没有具体要求,但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此,有条件建议湿转、半干转均在低温(4度)进行。此外,湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷,时间不能长于2hrs,否则电泳液冻结;mini3型有内置冰槽的,冰槽置-80度预冷。
制作转膜三明治的过程中,书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致,否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路,降低内阻增加电(压)流,造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限,如果每次都切割新滤纸,消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高,且增加额外的操作。因此,实际上滤纸大一些也不太要紧,但是我会选择已
经切割好的和胶面积最接近的滤纸;通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下,叠好后再碾压几个来回,力道要均匀、恰好;力量过大,胶会被拉伸,条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡(完全可以做到叠加的时候每一层