内容发布更新时间 : 2025/6/19 17:10:21星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。
如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。
这三种封闭蛋白的差异：
milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推荐gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin会逐渐溶解；由于gelatin可以灭菌（milk不可以），所以同样条件下，gelatin的存放时间明显长于milk。实际上，抗体可以反复用很久（通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候），通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度反复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。
抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。
由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待（多花点心思摸索吧）。
原装抗体的保存：
1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推荐。 2. 1：1加甘油，冻于-20度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛采用，诸如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查 ）。值得注意的是：不是所有的抗体都可以1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，如果说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。
显影——淬灭的祸因
当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。
首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：
交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发现很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP
浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭原因有联系。
当初我自制的ECL最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL同样也有保质期的问题，往往最先失效的组分就是过氧化物，尽管他们必然添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效的方法很简单，取稀释的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。
商品化的