内容发布更新时间 : 2024/11/15 18:57:17星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

实验一 细菌革兰氏染色法实验

一、实验内容

1. 学习微生物涂片及无菌操作技术； 2. 学习革兰氏染色技术。

二、实验目的

1．学习微生物涂片及无菌操作技术；

2．掌握革兰氏染色技术，了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类学上的意义； 3．进一步巩固显微镜的使用技术。

三、实验原理及实验步骤

（一）实验原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

（二）实验步骤

涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。（见图1） （1）涂片 ①常规涂片法

取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片（取菌时需保持无菌操作，以免污染菌源，无菌操作的方法和步骤见图2），干燥、固定（见图3）。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 ②“三区”涂片法

在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。

要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 （2）初染

滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 （3）媒染

用碘液媒染约l min，水洗。 （4）脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 （5）复染

在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。 （6）镜检

干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 （附显微镜的构造与使用步骤） （7）实验结束后处理

清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。

图1 革兰氏染色程序

1 加草酸铵结晶染 l min； 2水洗；3加碘液媒染 l min ； 4水洗； 5 乙醇脱色约 20 – 30s ；

6 水洗；7番红复染约 2 min； 8 水洗；9用吸水纸吸干

图2无菌操作过程 图3 涂片、干燥和热固定

四、实验器具材料

1.器材：显微镜、香泊油、二甲苯、擦镜纸、载玻片、接种环、酒精灯、火柴、吸水纸。 2.染色液及试剂：蒸馏水、结晶紫染色液、路戈氏碘液、95%的酒精、番红染色液。

3.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌斜面菌种。

五、思考题

1. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

2. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问 题?

3. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 应分别是什么颜色?

4. 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?

6. 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?

附：显微镜的构造与使用步骤

1、显微镜的主要构造

普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。见图4。

图4 普通光学显微镜的结构示意图

1.物镜转换器；2.物镜；3.游标卡尺；4.载物台；5.聚光器；6.彩虹光；7.光源；8.镜座； 9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋

（1）机械部分

①镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。

②镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。

③镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 ④镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。

⑤物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。

⑥镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。

⑦调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 a粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降，

所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。

b细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高

倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。 （2）照明部分

装在镜台下方，包括反光镜，集光器。

①反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。

②集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。

a聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。

b光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。 （3）光学部分

①目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。